Buscar

PUESTA A PUNTO DE FISH EN UN LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN BÁSICA.….de una técnica citogenética a otr

Ferez Ruiz Xavier: Consultor técnico-cientifico de
27 ago 2018
7 Min. de lectura

RESUMEN: Reproducir con éxito una técnica basándonos en un protocolo no es fácil, lo saben bien, desde los cocineros en su ambiente culinario con sus recetas, hasta un investigador en su laboratorio de investigación. Por ello nos proponemos describir la puesta a punto de una de las técnicas de fluorescencia más sensible, la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH), pero no en un laboratorio clínico y en una suspensión celular; sino en un laboratorio de investigación básica y en tejido neuronal.

1.Introducción.

La técnica de hibridación fluorescente in situ tuvo sus comienzos experimentales a finales de la década de 19801, si bien es esos comienzos se utilizaba una sonda biotinilizada de ADN repetitiva específica del cromosoma Y con el propósito de detectar células portadoras del cromosoma Y en muestras de sangre y médula ósea de pacientes con tumores hematopoyéticos después de un trasplante de médula ósea. Esta técnica innovadora era muy sensible y permitía a los investigadores identificar las células implantadas de donantes femeninos en receptores masculinos. Muy pronto se comenzó a emplear este nuevo método de detección en la comunidad científica para evaluar la expresión de proteínas como la beta-globina2, usando sondas ARN monocatenario. A comienzos de este milenio la FISH ya se usaba ampliamente en la clínica, como era de esperar, con fines de diagnósticos molecular, para detectar alteraciones genéticas en el genoma3.

El propósito de este grupo de investigación era localizar células huéspedes humanas después de su inyección en un hospedador, usando como modelo animal al ratón de laboratorio. La localización de células inyectadas en un modelo animal siempre ha sido un tema apasionante para el diseño experimental en el método científico, y tal como diseñaran estos pioneros hace más de 30 años1,2, quisimos localizar estas células mediante marcadores citogenéticos propios de células humanas, en este caso de los marcadores BCR y ABL.

Para ello usando sondas génicas BCR/ABL y mediante técnica de FISH, localizaremos células madres hematopoyéticas humanas (HSC) infundidas en el cerebro de ratón.

Debemos tener en cuentas las diferencias en cuanto a medios, a la hora de poner a punto una nueva técnica en un laboratorio de investigación o en un laboratorio clínico, teniendo en cuenta la necesidad de medios técnicos y económicos elevados concretamente para la FISH..

2.Resultados.

La eficacia y eficiencia del proceso de puesta a punto de toda técnica de investigación, es primordial, para ello debemos asegurarnos que cada paso es certero y reproducible, con un hábil diseño de sus controles positivos y por su puesto de los controles negativos.

FISH de sonda centromérica para cromosoma 7 sobre suspensión celular. (Fig.1)
FISH de sonda centromérica para cromosoma 7 sobre tejido neuronal. (Fig.2)
FISH BCR/ABL para suspensión celular. (Fig.3)
FISH BCR/ABL sobre tejido neuronal. (Fig.4)

Es por ello que decidimos, una vez asegurado los soportes técnicos, los materiales y la disponibilidad de las muestras, empezar reproduciendo los protocolos rutinarios de una FISH en la clínica hospitalaria, es decir sobre una muestra de suspensión celular como es la sangre, pero con una sonda centromérica para empezar.

Conseguimos permeabilizar la membrana nuclear de las células sanguíneas y marcar a sus cromosomas 7 tal como se aprecia en la figura 1.

Así que nos propusimos abordar al tejido, consciente del uso de una sonda comercial diseñada para hibridar sobre células en suspensión como es la sangre y no sobre un tejido tan peculiar como el tejido nervioso rico en cerebrósidos y esfingomielina (estructuras paracristalinas). Tras varios intentos tuvimos que modificar los protocolos “comerciales” que están implantados en los laboratorios de diagnóstico clínico de los hospitales donde se llevan a cabo FISH de manera rutinaria en suspensiones celulares.

Obtuvimos señal con el cromosoma 7 de células de cerebelo humano y conseguimos una cierta recuperación antigénica, al marcar la beta-tubulina III del tejido neuronal (Fig.2).

Llego el momento de probar nuestra sonda BCR/ABL sobre una suspensión celular de una muestra sanguínea de sujeto sano como control negativo y un donante con LMC como control positivo. Los resultados reproducián aquellas señales que se aprecian en cualquier laboratorio clínico (Fig 3).

Finalmente y la novedad de estos ensayos, era poner a punto la FISH con la sonda BCR/ABL en nuestro laboratorio de investigación y en un tejido tan complejo como el cerebral. Tuvimos que superar problemas de permeabilización, recuperación antigénica, conservación de las muestras …ect. Y podemos mostraros los resultados (Fig 4).

3. Material y método.

3.1. Material.

La sonda comercial de doble fusión usada de rutina en laboratorio de citogénética para el diagnóstico de la Leucemia Mieloide Crónica (LMC) que hemos empleado (Fig.5) contiene una mezcla de dos sondas, una de BCR y otra de ABL. También contiene una sonda para el gen ASS.

La mezcla de sondas BCR contiene dos sondas para el cromosoma 22: una sonda 3 'del BCR que cubre una región que se extiende 171 kb 3', que abarca los genes GNAZ y RAB36 y una segunda sonda que cubre una región de 148 kb. Ambas están marcadas en verde (FITC). La mezcla de sondas ABL contiene a su vez tres sondas para el cromosoma 9 de 176 kb, 173 kb y una sonda adicional de 193 kb de longitud que se extiende por todo el gen ASS. Estas sondas para el cromosoma 9 están marcadas en rojo (Texa Red).

Dado el diseño experimental y teniendo en cuenta los controles positivos y negativos para comprobar la técnica, empleamos como muestras: sangre periférica y aféresis de sujetos sanos y de un paciente con leucemia mieloide crónica (LMC); tejido de cerebelo humano sano; cerebro de ratones adulto normales swiss e inmunodeprimidos (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rgtm1Wjl/SzJ), cerebro de neonatos de ratones.

Todas las muestras humanas se obtuvieron previo consentimiento informado de conformidad con la Declaración de Helsinki. El manejo de los animales y los experimentos se realizaron de acuerdo con la Normativa Europea y el Real Decreto 1201/2005, sobre protección de los animales utilizados para experimentación. Todas las fases del diseño experimental contaron con el informe favorable del Comité de Bioética de la Universidad y del Hospital.

3.2. Método.

La biología molecular y concretamente dentro de su ámbito, la FISH como técnica de análisis genético de marcaje con sondas fluorescentes, ha representado una importante herramienta diagnóstica dada su alta sensibilidad y especificidad.

La puesta a punto de una técnica, siempre requiere un esfuerzo humano y económico. En el caso de estos ensayos, el esfuerzo ha sido mayor por dos motivos: primero por el uso de una sonda comercial diseñada para hibridar sobre células en suspensión como es la sangre y no sobre un tejido tan peculiar como el tejido nervioso rico en cerebrósidos y esfingomielina (estructuras paracristalinas). Segundo por el número y tamaño de la sonda, pues de trata de 5 sondas con un tamaño medio de 172 kb. Ambas circunstancias nos llevó a modificar los protocolos comerciales de permeabilización, para que los marcadores fluorescentes pudieran alcanzar sus dianas, sus locus génicos. Tuvimos que modificar dos protocolos clínicos de dos casas comerciarles y dos protocolos experimentales de dos centros de investigación.

La técnica de hibridación in situ (FISH) para muestras de tejido nervioso incluido en parafina cortada a 3 micras con microtomo Leica sobre portas con poli-l-lisina, se inicia con un proceso de desparafinación : portas a 60ºC durante 60 minutos, tres pases de Xilol de 10 minutos, dos pases de alcohol 100º de 5 minutos, dos pases de alcohol 70º de 5 minutos y finalmente un pase en agua bidestilada de 5 minutos para dejar secar. La recuperación antigénica con calor se realiza en olla Express con tampón Citrato Sódico Salino SSC 1x durante 5 minutos, para lavar en agua bidestilada y dejar secar. La permeabilización se realiza por digestión enzimática mediante proteinasa K depositando 100 ul de una disolución del enzima en SSC 2x a 60 ug/ml sobre cada porta y cubriendolo con cubre, se mantiene sobre placa calefactora a 37ºC durante 25 minutos. Para facilitar la retirada de los cubres, se sumergen los portas en SSC 1x durante 5 minutos y se deja secar.

El marcaje de las muestras, se inicia con la preparación de la sonda, tal como nos indica el Kit comercial: 1 ul de la sonda, 2 ul de agua ultrapura, 7 ul de tampón de hibridación. Extendemos sin formar burbujas, 15 ul de la sonda, sobre cada porta de 22x60, depositamos los cubres y recubrimos con parafilm.

La hibridación de la sonda BCR/ABL con la muestra, se lleva a cabo mediante un termociclador-hibridador realizando la desnaturalización a 90ºC durante 5 minutos y la posterior incubación que termina tras 20 horas a 45ºC.

El segundo día de la FISH conlleva un lavado de los portas a 72ºC en una disolución SSC2X Tween 20 0.3% durante seis minutos. El procedimiento termina con el montaje de los portas con medio de montaje para fluorescencia (Vectashield H-100) después de una contración con DAPI.

4. Discusión y conclusión.

El procedimiento llevado a cabo, paso a paso, para poner a punto la aplicación de esta técnica citogenética en un contexto nuevo como técnica histogenética, llevo muchos esfuerzos a todo un equipo multidisciplinar que estaba muy ilusionado en que saliera adelante para sus futuras investigaciones a la hora de localizar células en un hospedador tras un xenotransplante. El protocolo experimental fue abriéndose paso, obstáculo tras obstáculo, solventando las dificultades, hasta conseguir las señales presentados en el capítulo de resultados. Esta nueva técnica histogenética permitirá a los investigadores en terapia celular comprobar el hospedaje y posterior implante de las células madres en el tejido a regenerar o a reparar.

5. Agradecimientos.

A la Universidad de Murcia, al Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca y al complejo asistencial universitario de Salamanca,

6. Bibliografía.

1 Leucemia. 1989 Oct; 3 (10): 724-8.